การเปรียบเทียบการยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบ แกรมบวกและฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดโพรพอลิสจากรังผึ้ง
- ชื่อนักเรียนผู้จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
กิ่งกาญจน์ นารินทร์ยาง, กนกวรรณ เพียโคตรแก้ว, พิรญาณ์ เขียนนอก
- อาจารย์ที่ปรึกษาโครงงานวิทยาศาสตร์
วัชราภรณ์ แสนนา
- โรงเรียนที่กำกับดูแลโครงงานวิทยาศาสตร์
- ปีที่จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
บทคัดย่อโครงงานวิทยาศาสตร์
ประเทศไทยมีแหล่งทรัพยากรที่มากมาย ส่งผลเอื้ออำนวยต่อการดำรงชีวิตของสิ่งมีชีวิตและก่อให้เกิดอาชีพแก่ผู้คนในประเทศ อันได้แก่การทำการเกษตร ทำไร่ ทำสวน หรือเลี้ยงสัตว์กล่าวมาถึงการเลี้ยงสัตว์ทำให้ค้นพบว่าสัตว์บางชนิดสามารถนำมาเลี้ยงและสร้างมูลค่าให้แก่เกษตรกรผู้เลี้ยงได้ กล่าวถึงการเลี้ยงผึ้ง ผึ้งมีความสามารถในการสร้างรังที่มีคุณลักษณะพิเศษคือมีโพรพอลิส (Propolis)เป็นองค์ประกอบหลักซึ่งสาร โพรพอลิส คือสารประกอบเรซินเหนียวสีน้ำตาลผสมกับไขผึ้ง ผึ้งเก็บโพรพอลิสมาจากต้นไม้เพื่อใช้ฆ่าเชื้อโรคภายในรัง ผึ้งยังใช้โพรพอลิสเป็นเสมือนกาวยารัง เป็นสารเคลือบสัตว์ที่เข้ามาตายภายในรังเพื่อมิให้เน่าเปื่อย แต่ปัญหาคือผู้เกษตรกรส่วนใหญ่ยังขาดองค์ความรู้ทางเภสัชของผึ้ง ซึ่งจะพบได้ว่าเกษตรกรเลี้ยงผึ้ง มีการเลี้ยงผึ้งเพื่อขายน้ำผึ้งเป็นหลักเท่านั้น คณะผู้จัดทำจึงศึกษาข้อมูลของผึ้ง พบว่าโพรพอลิสในรังผึ้งมีองค์ประกอบหลักที่สำคัญคือสารฟลาโวนอยด์และสารโพลิฟีนอล ที่มีคุณสมบัติทางเภสัชเคมีหลายประการอาทิยับยั้งแบคทีเรีย เชื้อรา ต้านสารอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ กระตุ้นระบบภูมิต้านทานในร่างกายเป็นต้น อีกทั้งยังพบว่ามีการพยายามศึกษาและคิดค้นนำเอาสารโพรพอลิสไปรักษาโรคมะเร็งจากคุณสมบัติยับยังการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย แต่การศึกษาและงานวิจัยเกี่ยวข้องกับโพรพอลิสในประเทศไทยยังมีไม่มากนัก
ดังนั้นคณะผู้จัดทำจึงสนใจศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของโพรพอลิส คุณสมบัติการยังยั้งแบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวกแตกต่างกันหรือไม่ และคุณสมบัติการต้านสารอนุมูลอิสระดีหรือด้อยกว่าคุณสมบัติการยับยั้งแบคทีเรีย เพื่อให้เกิดองค์ความรู้ใหม่และนำไปพัฒนาต่อยอดสารยับยั้งแบคทีเรียและสารต้านอนุมูลอิสระจากธรรมชาติที่มีประสิทธิภาพ และเพื่อใช้ทรัพยากรธรรมชาติที่มีให้เกิดประโยชน์อย่างสูงสุด
1.2วัตถุประสงค์
1.2.1 เพื่อศึกษาองค์ประกอบทางเคมีในโพรพอลิส(Propolis) จากรังผึ้ง
1.2.2 เพื่อศึกษาฤทธิ์การยับยั้งแบคทีเรียและฤทธิ์การต้านสารอนุมูลอิสระ ของสารฟลาโวนอยด์ในสารสกัดโพรพอลิสจากรังผึ้ง
1.2.3 เพื่อเปรียบเทียบฤทธิ์การยับยั้งแบคทีเรียของสารสกัดจากโพรพอลิสระหว่างแบคทีเรียแกรมลบแกรมบวก และฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระ
1.3 สมมติฐาน
สารฟลาโวนอยด์องค์ประกอบของสารสกัดโพรพอลิสที่ได้จากรังผึ้งสามารถยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวกได้ และมีคุณสมบัติในการต้านสารอนุมูลอิสระ
1.4 ตัวแปร
1.4.1 ตัวแปรต้น สารฟลาโวนอยด์
1.4.2 ตัวแปรตาม ประสิทธิภาพการยับยั้งแบคทีเรียแกรมบวกคือ Streptococcus pyogenes แบคทีเรียแกรมลบคือ Shigella flexneri และประสิทธิภาพการต้านอนุมูลอิสระ
1.4.3 ตัวแปรควบคุม แบคทีเรียและสารอนุมูลอิสระ
1.5 นิยามศัพท์เฉพาะ
1.5.1 แบคทีเรียแกรมบวก หมายถึง แบคทีเรีย(bacteria) ที่ย้อมแกรม(gram staining) ติดสีม่วง ไม่ติดสีแดงของ safranin
1.5.2 แบคทีเรียแกรมลบ หมายถึง แบคทีเรีย(bacteria) ที่ย้อมแกรม(gram staining) ติดสีแดงของ
Safranin
1.5.3 สารอนุมูลอิสระ หมายถึง สารซึ่งมีอิเล็กตรอนซึ่งไม่มีคู่อยู่ในวงรอบของอะตอม หรือโมเลกุล
1.6 นิยามศัพท์เชิงปฏิบัติการ
1.6.1 สารฟลาโวนอยด์ หมายถึง สารฟลาโวนอยด์ที่ได้จากการสกัดจากรังผึ้ง
1.6.2 ฤทธิ์การยับยั้งแบคทีเรีย หมายถึง ความสามารถในการลดอัตราการเจริญเติบโตหรือการเพิ่มจำนวนของแบคทีเรีย
1.6.3 ฤทธิ์ต้านสารอนุมูลอิสระ หมายถึง ความสามารถในการลดอัตราการการเจริญเติบโตหรืออัตราการเพิ่มจำนวนของอนุมูลอิสระ
1.7ขอบเขตการศึกษา
สารที่นำมาศึกษาจากธรรมชาติคือสารโพรโพลิสในรังผึ้ง การทดสอบสารอนุมูลอิสระใช้ทดสอบสารอนุมูลอิสระDPPH ใช้แบคทีเรียแกรมลบ Shigella flexneri แบคทีเรียแกรมบวก Streptococcus pyogenes
การทดสอบฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระของโพรโพลิสโดยวิธี DPPH
1.การเตรียมสารละลาย DPPH เข้มข้น 1.0 มิลลิโมลต่อลิตร ละลายด้วยเมทานอลใส่ขวดวัดปริมาตรขนาด 100 มิลลิลิตรจากนั้นปริมาตรด้วยเมทานอลจนครบปริมาตร 100 มิลลิลิตร
2.การทดสอบฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระ DPPH ทำโดยชั่งสารสกัดโพรพอลิสที่ทำการละลายด้วย ละลายด้วย 1% DMSO มาปิเปตสารละลายตัวอย่าง ใส่ในขวด vial ที่มีสารละลาย DPPH อยู่ จากนั้นทำการเขย่าเป็นเวลา 3 นาทีจากนั้นเก็บในที่มืดอุณหภูมิห้องเป็นเวลา 4 นาที จากนั้นนำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 517 นาโนเมตร โดยเครื่อง Spectronic Genesys 5 โดยใช้เอทานอแทนสารละลายแบลงค์ จากนั้นนำค่าดูดกลืนแสงที่ได้มาคำนวณหาเปอร์เซ็นต์การจับอนุมูลอิสระ DPPH ตามวิธีของ Kumaranและ Karunakarun (2006)
% DPPH free radical scavenging activity = [(〖 A〗_(0 )- A_1) / A_0 x 100]
โดยที่
A_0 = ค่าดูดกลืนแสงของสารละลายแบลงค์ (เอทานอล + DPPH) ที่เวลา 4 นาที
A_1 = ค่าดูดกลืนแสงของสารตัวอย่าง (สารสกัด + DPPH) ที่เวลา 4 นาที
การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย Shigella flexneri (แบคทีเรยแกรมลบ) และ Streptococcus pyogenes (แบคทีเรียแกรมบวก) โดยวิธี Disc Diffusion
การเตรียมตัวอย่างสารสกัดจากโพรพอลิส จากนั้นนำมาละลายในเอทานอลจากนั้นคนให้เข้ากันแล้วเอาไปกรองใน membrane filter ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วโดยการนึ่ง
การเตรียมเชื้อทดสอบ
เลี้ยงเชื้อ Shigella flexneri และ Streptococcus pyogenes บนอาหาร Blood agar (BA) และ Endo agar ( Endo's medium)ตามลำดับ เลี้ยงจนเชื้อครบ 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
ทำการศึกษาสัณฐานวิทยาของเชื้อแบคทีเรีย Shigella flexneri และ Streptococcus pyogenes -นำแบคทีเรียมาย้อมสีแกรม(gram staining) โดย Streptococcus pyogenes
(แบคทีเรียแกรมบวก)ติดสีม่วง ไม่ติดสีแดงของ safranin และ Shigella flexneri (แบคทีเรียแกรมลบ) ที่ย้อมแกรม(gram staining) ติดสีแดงของ Safranin
การทดสอบฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระของโพรโพลิสโดยวิธี DPPH
1.การเตรียมสารละลาย DPPH เข้มข้น 1.0 มิลลิโมลต่อลิตร ละลายด้วยเมทานอลใส่ขวดวัดปริมาตรขนาด 100 มิลลิลิตรจากนั้นปริมาตรด้วยเมทานอลจนครบปริมาตร 100 มิลลิลิตร
2.การทดสอบฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระ DPPH ทำโดยชั่งสารสกัดโพรพอลิสที่ทำการละลายด้วย ละลายด้วย 1% DMSO มาปิเปตสารละลายตัวอย่าง ใส่ในขวด vial ที่มีสารละลาย DPPH อยู่ จากนั้นทำการเขย่าเป็นเวลา 3 นาทีจากนั้นเก็บในที่มืดอุณหภูมิห้องเป็นเวลา 4 นาที จากนั้นนำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 517 นาโนเมตร โดยเครื่อง Spectronic Genesys 5 โดยใช้เอทานอแทนสารละลายแบลงค์ จากนั้นนำค่าดูดกลืนแสงที่ได้มาคำนวณหาเปอร์เซ็นต์การจับอนุมูลอิสระ DPPH ตามวิธีของ Kumaranและ Karunakarun (2006)
% DPPH free radical scavenging activity = [(〖 A〗_(0 )- A_1) / A_0 x 100]
โดยที่
A_0 = ค่าดูดกลืนแสงของสารละลายแบลงค์ (เอทานอล + DPPH) ที่เวลา 4 นาที
A_1 = ค่าดูดกลืนแสงของสารตัวอย่าง (สารสกัด + DPPH) ที่เวลา 4 นาที
การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย Shigella flexneri (แบคทีเรยแกรมลบ) และ Streptococcus pyogenes (แบคทีเรียแกรมบวก) โดยวิธี Disc Diffusion
การเตรียมตัวอย่างสารสกัดจากโพรพอลิส จากนั้นนำมาละลายในเอทานอลจากนั้นคนให้เข้ากันแล้วเอาไปกรองใน membrane filter ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วโดยการนึ่ง
การเตรียมเชื้อทดสอบ
เลี้ยงเชื้อ Shigella flexneri และ Streptococcus pyogenes บนอาหาร Blood agar (BA) และ Endo agar ( Endo's medium)ตามลำดับ เลี้ยงจนเชื้อครบ 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
ทำการศึกษาสัณฐานวิทยาของเชื้อแบคทีเรีย Shigella flexneri และ Streptococcus pyogenes -นำแบคทีเรียมาย้อมสีแกรม(gram staining) โดย Streptococcus pyogenes
(แบคทีเรียแกรมบวก)ติดสีม่วง ไม่ติดสีแดงของ safranin และ Shigella flexneri (แบคทีเรียแกรมลบ) ที่ย้อมแกรม(gram staining) ติดสีแดงของ Safranin
การทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดโพรพอลิสต่อการยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย Shigella flexneri และ Streptococcus pyogenes
ทดสอบด้วยวิธี Agar Disc Diffusion
นำ Paper Disc ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 6 เซนติเมตร ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วจุ่มลงในสารสกัด
โพรพอลิส ทิ้งไว้ให้แห้งวางบนอาหารที่เลี้ยงเชื้อไว้ น้ำเชื้อ Streptococcus pyogenes และ Shigella flexneri ไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
การแปลผลการทดลอง เมื่อบ่มเชื้อครบ 24 ชั่วโมง ทำการวัดขนาดโซนใสที่เกิดขึ้น โดยวัดจากโซนใสของอีกข้างหนึ่งไปยังโซนขอบอีกข้างหนึ่ง โดยให้เส้นผ่าศูนย์กลางของ paper disc (ขอบโซนที่วัดต้องเป็นโซนที่ชัด ถ้ามีเชื้อขึ้นบางๆ ให้ถือว่าบริเวณนั้นยังมีปริมาณยาหรือสารสกัด ชีวภาพสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได้) น้าผลการวัดความยาวของโซนใสที่เกิดขึ้นของเชื้อทดสอบ แต่ละชนิด นำมาหาค่าเฉลี่ยของเส้นผ่าศูนย์กลาง
ขนาดของโซนใส = (เส้นผ่าศูนย์กลางของ paper disc และโซนใสของเชื้อ) – (เส้นผ่าศูนย์กลางของ paper disc)(Inhibition zone; มิลลิเมตร)
จากนั้นทำการแปลผลการยับยั้งของสารสกัดมาตรฐาน CLSI ซึ่งแบ่งเป็น 3 ระดับ คือ
Susceptible (Sensitive: s) คือ ให้โซนใสมากกว่า 16 มิลลิเมตรขึ้นไป
Intermediate (I) คือ ให้โซนใสอยู่ในช่วง 8-16 มิลลิเมตร
Resistant (T) คือ ให้โซนใสน้อยกว่า 8 มิลลิเมตร
หมายเหตุ: paper disc มีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 6 มิลลิเมตร