การศึกษาการแสดงออกและการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ที่ผลิตโดย Acinetobactor buamanii
- ชื่อนักเรียนผู้จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
ศศิกานต์ ใจชื้น, จุฑาทิพย์ ชูจิตร
- อาจารย์ที่ปรึกษาโครงงานวิทยาศาสตร์
ฉัตรธิดา ชัยโพธิ์ศรี
- โรงเรียนที่กำกับดูแลโครงงานวิทยาศาสตร์
- ปีที่จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
บทคัดย่อโครงงานวิทยาศาสตร์
การศึกษาทดลองเรื่อง การศึกษาการแสดงออกและการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ที่ผลิตโดยเชื้อ E.coli ชนิด Acinetobactor buamanii ครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อวัดค่าการเจริญเติบโตของเชื้อ E.coli ที่มีการทำงานแตกต่างจากเชื้อ E.coli ชนิดอื่น เพื่อศึกษา activity ของ โปรตีน จากเชื้อ E.coli ที่มีการทำงานแตกต่างจากเชื้อ E.coli ชนิดอื่น ดำเนินการทดสอบโดยแบ่งการทดลองเป็น 10 ข้อ 1.การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย Mueller Hinton Agar (MHA)
2.อาหารเลี้ยงเชื้อ เชื้อ E.coli คือ Mueller Hinton Agar (MHA) จะใช้จำนวนอย่างละ 1 plates
3.เขย่าหลอด broth culture บรรจุแบคทีเรีย ด้วยการแกว่งเบาๆให้ cells ของแบคทีเรียกระจายตัวอย่างสม่ำเสมอ เชื้อที่ใช้ต้องมีค่าความขุ่น 0.5 Mcfarland ขั้นตอนต่อจากนี้ไปให้ทำโดยใช้ aseptic techniques ตลอดการทดลองใช้ pipette ดูด broth culture ปริมาตร 0.1 ml นำมาหยอดลงบนผิวหน้าอาหารกลางจานอาหารเลี้ยงเชื้อแล้วใช้ glass spreader เกลี่ยเชื้อให้กระจายอย่างสม่ำเสมอทั่วผิวหน้า agar
4.นำ forceps มาจุ่มใน alcohol 70% ที่ส่วนปลายประมาณ 1-2 เซนติเมตร แล้วเผาส่วนปลายนั้นด้วยตะเกียงแอลกอฮอล์เพื่อฆ่าเชื้อ ให้จับforcepsในลักษณะปลายชี้ลงเสมอ มิฉะนั้น alcohol จะไหลมาทางมือและไฟจะลามมาไหม้มือได้
5.ถือ forceps ไว้สักครู่เพื่อให้เย็นลง แล้วจึงใช้คีบที่ส่วนขอบของ paper disk นำมาวางลงตรงกลางจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้ spread แบคทีเรียไว้แล้ว โดยวางครั้งเดียวให้ได้ตรงตำแหน่งที่ต้องการ ระวังอย่าให้ forceps สัมผัสกับผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อ
6.นำ micropipette ขนาด 20ไมโครลิตรมาหมุนปุ่มปรับตั้งปริมาตร 10ไมโครลิตร (หมุนจากปริมาตรสูงกว่าลงมาที่ขีด10ไมโครลิตร) นำ micropipette ไปกดเอา pipette tip ที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อแล้วจากในกล่อง
7.ใช้นิ้วหัวแม่มือข้างที่ถือ กดปุ่มลูกสูบด้านบน micropipette ลงจนถึง first stop เพื่อให้ได้ปริมาตร 10 ไมโครลิตรและคงไว้ที่ตำแหน่งนั้น ถือ micropipette ในแนวตั้งตรง (vertical) จุ่มปลาย pipette tip ลงใน Kanamycin ลึกประมาณ 3 มิลลิเมตร ปล่อยนิ้วหัวแม่มือที่กดปุ่มอย่างช้าๆ ด้วยความเร็วคงที่ เพื่อดูด Kanamycin เข้ามาใน pipette tip จนสุดปริมาตรที่ตั้งไว้ ถือ micropipette ให้ tip จุ่มอยู่ใน Kanamycin นิ่งไว้ 3 วินาที จึงยกขึ้นช้าๆ
8.ปล่อย Kanamycin ที่ดูดมาลงบน paper disk ใน plate โดยจ่อปลาย tip ใกล้ ๆ paper disk พร้อมกับกดปุ่มปล่อยสารสกัดออกจาก tip ช้าๆ จนถึง first stop และรอจน Kanamycin ไหล แล้วจึงกดปุ่มต่อลงไปจนถึง second stop เพื่อไล่น้ำสารกัดส่วนที่ค้างอยู่ใน tip ออกให้หมด กดค้างไว้พร้อมกับยก pipette ขึ้นช้าๆและปิดฝา plate
9.ทำเช่นเดียวกันนี้ จากข้อ 4-8 กับอาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้ spread แบคทีเรียไว้แล้วอีก 1 จานที่เหลือ
10.นำจานมาเลี้ยงเชื้อทั้ง 2 จานที่ได้ inoculate เชื้อและวาง paper disk ใช้ยางรัดปากถุงกันเชื้อแบคทีเรียอื่นๆที่อาจเข้าไปรบกวน แต่อย่ารัดแน่นมาก ให้เชื้อแบคทีเรียได้มีอากาศเพื่อการเจริญแล้วนำไปบ่มใน incubator ที่อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง
ผลการทดลองสรุปได้ดังนี้
จากการทำ SDS-PAGE พบว่าโปรตีนจาก E.coli BL21(T9A) ที่สนใจจะเคลื่อนที่ไปตรงกับตำแหน่งแบนที่ 2 ของ protein marker (นับจากล่างขึ้นบน) ทำให้ทราบว่าโปรตีนจากE.coli BL21(T9A) นั้นมีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ protein marker ในตำแหน่งที่ 2 คือ 19 กิโลดาลตัน (kDa) และ พบว่าโปรตีนจาก E.coli BL21 (F23A) ที่สนใจจะเคลื่อนที่ไปตรงกับตำแหน่งแบนที่ 2 ของ protein marker (นับจากล่างขึ้นบน) ทำให้ทราบว่าโปรตีนจาก E.coli BL21(F23A) นั้นมีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ protein marker ในตำแหน่งที่ 2 คือ 17 กิโลดาลตัน (kDa)