การเปรียบเทียบประสิทธิภาพการยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบ แกรมบวก และฤทธิ์การต้านสารอนุมูลอิสระของสารสกัดโพรพอลิสจากรังผึ้ง

ชื่อนักเรียนผู้จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์

กนกวรรณ เพียโคตรแก้ว, พิรญาณ์ เขียนนอก, กิ่งกาญจน์ นารินทร์ยาง

อาจารย์ที่ปรึกษาโครงงานวิทยาศาสตร์

วัชราภรณ์ แสนนา

โรงเรียนที่กำกับดูแลโครงงานวิทยาศาสตร์

โรงเรียนวิทยาศาสตร์จุฬาภรณราชวิทยาลัย บุรีรัมย์

ปีที่จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์

พ.ศ. 2560

บทคัดย่อโครงงานวิทยาศาสตร์

ผึ้งมีความสามารถในการสร้างรังที่มีคุณลักษณะพิเศษคือมีโพรพอลิส (Propolis)เป็นองค์ประกอบหลักซึ่งสาร โพรพอลิส คือสารประกอบเรซินเหนียวสีน้ำตาลผสมกับไขผึ้ง ผึ้งเก็บโพรพอลิสมาจากต้นไม้เพื่อใช้ฆ่าเชื้อโรคภายในรัง ผึ้งยังใช้โพรพอลิสเป็นเสมือนกาวยารัง เป็นสารเคลือบสัตว์ที่เข้ามาตายภายในรังเพื่อมิให้เน่าเปื่อย แต่ปัญหาคือผู้เกษตรกรส่วนใหญ่ยังขาดองค์ความรู้ทางเภสัชของผึ้ง ซึ่งจะพบได้ว่าเกษตรกรเลี้ยงผึ้ง มีการเลี้ยงผึ้งเพื่อขายน้ำผึ้งเป็นหลักเท่านั้น คณะผู้จัดทำจึงศึกษาข้อมูลของผึ้ง พบว่าโพรพอลิสในรังผึ้งมีองค์ประกอบหลักที่สำคัญคือสารฟลาโวนอยด์และสารโพลิฟีนอล ที่มีคุณสมบัติทางเภสัชเคมีหลายประการอาทิยับยั้งแบคทีเรีย เชื้อรา ต้านสารอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ กระตุ้นระบบภูมิต้านทานในร่างกายเป็นต้น อีกทั้งยังพบว่ามีการพยายามศึกษาและคิดค้นนำเอาสารโพรพอลิสไปรักษาโรคมะเร็งจากคุณสมบัติยับยังการเจริญเติบโตของแบคทีเรียดังนั้นคณะผู้จัดทำจึงสนใจศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของโพรพอลิส คุณสมบัติการยังยั้งแบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวกแตกต่างกันหรือไม่ และคุณสมบัติการต้านสารอนุมูลอิสระดีหรือด้อยกว่าคุณสมบัติการยับยั้งแบคทีเรีย เพื่อให้เกิดองค์ความรู้ใหม่และนำไปพัฒนาต่อยอดสารยับยั้งแบคทีเรียและสารต้านอนุมูลอิสระจากธรรมชาติที่มีประสิทธิภาพ และเพื่อใช้ทรัพยากรธรรมชาติที่มีให้เกิดประโยชน์อย่างสูงสุด

การสกัดสารโพรโพลิส

นำสารสกัดโพพอลิสที่ได้มาละลายด้วยน้ำกลั่นและเอธิลแอลกอฮอล์ที่ความเข้มข้นต่างๆ คือ 95%, 70%, 40% และ 5% ตามลำดับ โดยใช้ปริมาตรของสารละลาย 100 มิลลิลิตร

การทดสอบฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระของโพรโพลิสโดยวิธี DPPH

1.การเตรียมสารละลาย DPPH เข้มข้น 1.0 มิลลิโมลต่อลิตร ละลายด้วยเมทานอลใส่ขวดวัดปริมาตรขนาด 100 มิลลิลิตรจากนั้นปริมาตรด้วยเมทานอลจนครบปริมาตร 100 มิลลิลิตร

2.การทดสอบฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระ DPPH ทำโดยชั่งสารสกัดโพรพอลิสที่ทำการละลายด้วย ละลายด้วย 1% DMSO มาปิเปตสารละลายตัวอย่าง ใส่ในขวด vial ที่มีสารละลาย DPPH อยู่ จากนั้นทำการเขย่าเป็นเวลา 3 นาทีจากนั้นเก็บในที่มืดอุณหภูมิห้องเป็นเวลา 4 นาที จากนั้นนำไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 517 นาโนเมตร โดยเครื่อง Spectronic Genesys 5 โดยใช้เอทานอแทนสารละลายแบลงค์ จากนั้นนำค่าดูดกลืนแสงที่ได้มาคำนวณหาเปอร์เซ็นต์การจับอนุมูลอิสระ DPPH ตามวิธีของ Kumaranและ Karunakarun (2006)

การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย Shigella flexneri (แบคทีเรยแกรมลบ) และ Streptococcus pyogenes (แบคทีเรียแกรมบวก) โดยวิธี Disc Diffusion

  1. การเตรียมตัวอย่างสารสกัดจากโพรพอลิส จากนั้นนำมาละลายในเอทานอลจากนั้นคนให้เข้ากันแล้วเอาไปกรองใน membrane filter ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วโดยการนึ่ง

  1. การเตรียมเชื้อทดสอบ

เลี้ยงเชื้อ Shigella flexneri และ Streptococcus pyogenes บนอาหาร Blood agar (BA) และ Endo agar ( Endo's medium)ตามลำดับ เลี้ยงจนเชื้อครบ 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส

  1. ทำการศึกษาสัณฐานวิทยาของเชื้อแบคทีเรีย Shigella flexneri และ Streptococcus pyogenes -นำแบคทีเรียมาย้อมสีแกรม(gram staining) โดย Streptococcus pyogenes

(แบคทีเรียแกรมบวก)ติดสีม่วง ไม่ติดสีแดงของ safranin และ Shigella flexneri (แบคทีเรียแกรมลบ) ที่ย้อมแกรม(gram staining) ติดสีแดงของ Safranin

  1. การทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดโพรพอลิสต่อการยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย Shigella flexneri และ Streptococcus pyogenes

  • ทดสอบด้วยวิธี Agar Disc Diffusion

  • นำ Paper Disc ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 6 เซนติเมตร ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วจุ่มลงในสารสกัด

โพรพอลิส ทิ้งไว้ให้แห้งวางบนอาหารที่เลี้ยงเชื้อไว้ น้ำเชื้อ Streptococcus pyogenes และ Shigella flexneri ไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส

  • การแปลผลการทดลอง เมื่อบ่มเชื้อครบ 24 ชั่วโมง ทำการวัดขนาดโซนใสที่เกิดขึ้น โดยวัดจากโซนใสของอีกข้างหนึ่งไปยังโซนขอบอีกข้างหนึ่ง โดยให้เส้นผ่าศูนย์กลางของ paper disc (ขอบโซนที่วัดต้องเป็นโซนที่ชัด ถ้ามีเชื้อขึ้นบางๆ ให้ถือว่าบริเวณนั้นยังมีปริมาณยาหรือสารสกัด ชีวภาพสามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได้) น้าผลการวัดความยาวของโซนใสที่เกิดขึ้นของเชื้อทดสอบ แต่ละชนิด นำมาหาค่าเฉลี่ยของเส้นผ่าศูนย์กลาง