การศึกษาสารสกัดจากผักแขยงในการควบคุมโรคแอนแทรคโนสของมะม่วง
- ชื่อนักเรียนผู้จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
สุมินทรา คณาสาร, นันทิกานต์ อินทร์ขาว, ชลิตา โคตรหลักคำ
- อาจารย์ที่ปรึกษาโครงงานวิทยาศาสตร์
ตฤษยา จินาพร
- โรงเรียนที่กำกับดูแลโครงงานวิทยาศาสตร์
- ปีที่จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
บทคัดย่อโครงงานวิทยาศาสตร์
บทนำ
มะม่วง (ชื่อวิทยาศาสตร์: Mangifera Indica) เป็นไม้ยืนต้นในสกุล Mangifera ซึ่งเป็นไม้ผลเมืองร้อนในวงศ์ Anacardiaceae (กลุ่มเดียวกับถั่วพิสตาชีโอและมะม่วงหิมพานต์) เป็นพืชที่มีถิ่นกำเนิดในอินเดีย ในประเทศไทยมะม่วงเป็นผลไม้เศรษฐกิจ ปลูกเป็นพืชสวน ประเทศไทยส่งออกมะม่วงเป็นอันดับ 3 รองจากฟิลิปปินส์ และเม็กซิโก แต่เนื่องจากปัญหาที่เกิดจากโรคแอนแทรคโนส ซึ่งนอกจากจะทำความเสียหายต่อการผลิตมะม่วงอย่างรุนแรงแล้วเกษตรกรยังขาดความรู้เกี่ยวกับโรคและแนวทางแก้ปัญหาอย่างมีประสิทธิภาพและทันเหตุการณ์ (https://th.wikipedia.org/wiki/มะม่วง , 2550)
โรคแอนแทรคโนสในมะม่วง สาเหตุเกิดจากเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz.อาการบนใบอ่อนเริ่มจากการเป็นจุด ชุ่มน้ำและเปลี่ยนเป็นสีดำต่อไป บริเวณที่เป็นแผลจะหดตัวเล็กลงเล็กน้อยจนดึงให้ใบบิดเบี้ยว ใบแก่ขนาดของจุดจะมีขนาดคงที่ค่อนข้างเป็นเหลี่ยม เมื่อมะม่วงแทงช่อดอก เชื้อจะเข้าทำลายที่ช่อดอก ทำให้ช่อดอกแห้ง ดอกร่วง ช่อที่ติดผลอ่อนรวมทั้ง ผลแก่จะมีแผลเน่าดำ ในสภาพอากาศที่มีความชื้นสูง จะมีสปอร์สีชมพูเกิดขึ้นตามแผลที่เป็นโรค (สำนักงานส่งเสริมการปกครองท้องถิ่นจังหวัดสิงห์บุรี , 2563)
การป้องกันกำจัดโรคแอนแทรคโนสของมะม่วงมีหลายวิธีวิธีการใช้สารเคมีเกษตรกรนิยมใช้กันมากที่สุดโดยการฉีดพ่นป้องกันตั้งแต่ระยะก่อนการเก็บเกี่ยวและการจ่มผลมะม่วงในสาร TBZ (thiabendazole) ก่อนทำการอบไอน้ำเพื่อส่งเข้าประเทศญี่ปุ่นพบว่าช่วยลดความรุนแรงของโรคได้มาก แต่ในทางปฏิบัติยังมีปัญหากับผู้ซื้อสารเคมีที่ใช้กันมากในกลุ่ม Benzimidazole สามารถใช้ได้ก่อนและหลังการเก็บเกี่ยวแต่มีข้อเสียคือเชื้อราสร้างความต้านทานได้มากที่สุดราคาแพงและมีพิษตกค้างในสิ่งแวดล้อม (วิทยา , 2541)
ดังนั้นคณะผู้จัดทำจึงได้เลือกผักแขยงเนื่องจากเป็นพืชท้องถิ่นที่พบมากในจังหวัดอำนาจเจริญและเป็นพืชศึกษาในงานสวนพฤกษศาสตร์โรงเรียนอำนาจเจริญน้ำมันหอมระเหยจากผักแขยงมีฤทธิ์ต่อต้านจุลินทรีย์และน้ำมันหอมระเหยของผักแขยงยังมีคุณสมบัติเป็นยาฆ่าแมลงในกลุ่มที่ทำลายผลไม้ได้จึงนำมาเป็นแนวทางในการทดสอบประสิทธิ์ภาพในการควบคุมเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. ที่ก่อให้เกิดโรคแอนแทรคโนสในมะม่วง โดยสกัดด้วยตัวทำละลายเอทานอล 95 เปอร์เซ็น ซึ่งใช้ความเข้มข้นที่แตกต่างกัน จากนั้นนำไปทดสอบประสิทธิภาพ
ในการควบคุมเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. เพื่อใช้เป็นข้อมูลในการป้องกันและกำจัดเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. อย่างถูกต้อง มีประสิทธิภาพและมีความปลอดภัยกับสิ่งแวดล้อม
ปัญหา เนื่องจากเกษตรกรที่ปลูกมะม่วงจำนวนมากประสบกับปัญหาเกี่ยวกับเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. ที่ก่อให้เกิดโรคแอนแทรคโนสในมะม่วง ทำให้เกษตรกรแก้ปัญหาโดยการใช้สารเคมี ซึ่งส่งผลกระทบต่อผู้บริโภคและสิ่งแวดล้อม
สมมติฐาน
สารสกัดจากผักแขยงสามารถควบคุมโรคแอนแทรคโนสของมะม่วงได้
กระบวนการหรือขั้นตอนในการทำโครงงานอย่างละเอียด
การทำอาหารเลี้ยงเชื้อ
หั่นมันฝรั่งเป็นลูกเต๋าปริมาณ 200 กรัม นำไปใส่ในบีกเกอร์ เติมน้ำ 800 ml และนำเข้าไมโครเวฟโดยใช้กำลังไฟฟ้า 800 วัตต์ เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นกรองมันฝรั่งออก ใส่ผงวุ้น 15 กรัม น้ำตาล 20 กรัม แล้วเติมน้ำจนได้ปริมาตร 1 ลิตร ใช้แท่งแก้วคนให้เข้ากัน นำเข้าไมโครเวฟอีกครั้งโดยให้ความร้อนจนกว่า ผงวุ้นและน้ำตาลจะละลาย จากนั้นเทใส่ขวดแก้ว ปั้นสำลีเป็นก้อนสำหรับอุดปากขวดให้แน่น ปิดด้วยถุงพลาสติกครอบปากขวดและรัดด้วยหนังยาง แล้วนำไปนึ่งในหม้ออัดแรงดันเป็นเวลา 15 นาที
การเตรียมจานเพาะเลี้ยงเชื้อ
นำจานเลี้ยงเชื้อใส่ในกระบอกสแตนเลส หรือห่อด้วยกระดาษฟลิปชาร์ท เข้าตู้อบลมร้อนที่อุณหภูมิ 160 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 ชั่วโมง
การแยกเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. จากมะม่วงที่เกิดโรค
นำตัวอย่างมะม่วงที่เป็นโรคแอนแทรคโนส มาทำการฟอกเนื้อเยื่อ โดยการแช่มะม่วงในแอลกอฮอล์ 95 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 3-5 วินาที จากนั้นนำมะม่วงใส่ในสารละลาย Clorox 10 เปอร์เซ็นต์ เขย่าไปเรื่อยๆ เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วยล้างน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ 5 ครั้ง ครั้งละ 1 นาที จากนั้นทำการตัดเนื้อเยื่อ ซึ่งเป็นรอยต่อระหว่างเนื้อเยื่อปกติและเนื้อเยื่อที่เป็นโรคแอนแทรคโนสวางบนอาหารเลี้ยงเชื้อ จากนั้นใช้แผ่น parafilm พันรอบจานเลี้ยงเชื้อให้สนิทและเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิห้อง
**หมายเหตุ คณะผู้จัดทำได้นำเชื้อ Colletotrichum gloeosporioides Penz. มาจากแล็ปจุลชีววิทยาทางการเกษตร โครงการจัดตั้งวิทยาเขตอำนาจเจริญ มหาวิทยาลัยมหิดล
การสกัดสารจากผักแขยงโดยเอทานอล
ล้างผักแขยงด้วยน้ำสะอาด ผึ่งลมให้แห้ง จากนั้นหั่นให้ชิ้นเล็กก่อนนำไปปั่นให้ละเอียด แล้วแช่ด้วยตัวทำละลายเอทานอล 95 เปอร์เซ็น ในอัตราส่วน 1:3 ปิดฝา เขย่าให้เข้ากัน เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นให้แยกผักแขยงออกจากสารละลายโดยใช้ผ้าขาวบาง กรองด้วยกระดาษกรอง นำสารละลายไประเหยในตู้อบลมร้อน เป็นเวลา 4 วัน
การเตรียมความเข้มข้นของสารสกัดจากผักแขยง
ในการทดลองใช้ความเข้มข้นของสารสกัดจากผักแขยงที่ระดับความเข้มข้น 0 g/ml , 0.01 g/ml , 0.02 g/ml และ 0.03 g/ml โดยนำมาเจือจางด้วยน้ำกลั่นเพื่อให้ได้ความเข้มข้นที่ต้องการ ต่อไปทำการกรองแบคทีเรียด้วยเข็มฉีดยาที่ต่อเข้ากับตัวกรองแบคทีเรียฟิวเตอร์ จากนั้นนำสารสกัดที่กรองแล้วใส่บนผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อ ปริมาตร 0.2 ml แล้วเกลี่ยสารสกัดให้ทั่วโดยแท่งแก้วรูปตัวแอล
การศึกษาประสิทธิภาพในการควบคุมเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz.
การเตรียมเชื้อราที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อใช้ Cork borer เบอร์ 4 เจาะลงบนเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. แล้วย้ายไปวางบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ที่เตรียมไว้ โดยวางให้เชื้อราสัมผัสกับผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อ ตรงกึ่งกลางของอาหารเลี้ยงเชื้อ ใช้แผ่น parafilm พันรอบจานเลี้ยงเชื้อให้สนิทเมื่อเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. ติดกับอาหารเลี้ยงเชื้อแล้วให้คว่ำจานเลี้ยงเชื้อเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนจากไอน้ำ โดยอุปกรณ์แต่ละชิ้นต้องทำการฆ่าเชื้อโดยการจุ่มแอลกอฮอล์แล้วเผาด้วยตะเกียงแอลกอฮอล์ เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนเช่นเดียวกัน จากนั้นเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิห้อง วัดขนาดโคโลนีของเชื้อราในแต่ละวันจนกว่าจะเต็มจานเลี้ยงเชื้อวัดส่วนที่แคบที่สุดและกว้างที่สุด เวลาที่ทำการวัดจะต้องเป็นช่วงเวลาเดียวกัน โดยอุปกรณ์ที่ใช้ในการวัด คือ เวอร์เนียคาลิปเปอร์แบบดิจิตอล
การวิเคราะห์ข้อมูล
สูตรคำนวณเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง (percent inhibition of radial growth; PIRG) เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง (%) = ((A - B))/A x 100
A = ค่าเฉลี่ยการเจริญเติบโตของเชื้อราบนอาหาร (ชุดควบคุม)
B = ค่าเฉลี่ยการเจริญเติบโตของเชื้อราบนอาหารที่ผสมสารสกัดหยาบ (ชุดทดสอบ)
วางแผนการทดลองแบบ CRD (Completely Randomized Design)
มีจำนวนการศึกษาประสิทธิภาพในการควบคุมเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. จำนวน 4 กรรมวิธี (Treatment)
T1 = ชุดควบคุม (Control) มีสารสกัดจากผักแขยง 0.00 g/ml
T2 = PDA + 0.5 g/ml (สารสกัดจากผักแขยง)
T3 = PDA + 1.0 g/ml (สารสกัดจากผักแขยง)
T4 = PDA + 1.5 g/ml (สารสกัดจากผักแขยง)
ประโยชน์และผลที่คาดว่าจะได้รับ
สามารถนำสารสกัดจากผักแขยงมาใช้ในการควบคุมเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
ได้ทราบว่าที่ความเข้มข้นเท่าใดที่จะสามารถควบคุมเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากที่สุด
ได้แนวทางในการป้องกันเชื้อรา Colletotrichum gloeosporioides Penz. อีกทั้งยังสามารถนำไปประยุกต์ใช้เพื่อให้เกิดประโยชน์ในด้านการเกษตร