การประยุกต์ใช้สารสกัดเพคตินจากเครือหมาน้อยสำหรับเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย และใช้ในการแยกดีเอ็นเอด้วยเทคนิค electrophoresis
- ชื่อนักเรียนผู้จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
ธิดา ราชา, ณัฐสุดา นิลสนธิ, ลภัสรดา เตรียมวิทยา
- อาจารย์ที่ปรึกษาโครงงานวิทยาศาสตร์
หิรัญ แซ่ลิ่ม
- โรงเรียนที่กำกับดูแลโครงงานวิทยาศาสตร์
- ปีที่จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
บทคัดย่อโครงงานวิทยาศาสตร์
วุ้น (Agar) เป็นพอลิแซ็กคาไรด์ที่สกัดได้จากสาหร่ายสีแดง (Gracilaria sp.) มีพอลีแซคคาไรด์ 2 ชนิดเป็นองค์ประกอบ คือ อะกาโรส (agarose) และอะกาโรเพคติน (Agaropectin) มีคุณสมบัติไม่ละลายในน้ำเย็น แต่ละลายได้ในน้ำเดือด หากนำผงวุ้นความเข้มข้น (1.5 % โดยมวลต่อปริมาตร) ไปให้ความร้อนจะมีลักษณะใสและเมื่อวางทิ้งไว้จะเกิดการแข็งตัวเป็นเจลที่อุณหภูมิ 32 – 39 องศาเซลเซียส โดยสามารถละลายตัวได้อีกครั้งเมื่อให้ความร้อนที่ 85 °c ขึ้นไป [3] ปัจจุบันมีการนำวุ้นมาใช้เพื่อการบริโภคโดยเป็นส่วนผสมในอาหารหลายประเภท เช่น วุ้น เยลลี่ เจล เป็นต้น นอกจากนี้ยังมีการนำวุ้นไปใช้ในการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย หรือนำไปสกัดให้มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้นจนได้เป็นอะกาโรส (agarose) ซึ่งมีโครงสร้างเป็นพอลิเมอร์เส้นตรงที่มีมวลโมเลกุลประมาณ 120,000 ดัลตัน (Da) ประกอบไปด้วยน้ำตาลไดแซ็กคาไรด์เรียกว่าอะกาโรไบโอส (agarobiose) หลายหน่วยย่อยมารวมกันเป็นพอลิเมอร์ โดยแต่ละหน่วยย่อยของอะกาโรสจะเกิดจากการรวมกันของน้ำตาล D-galactose และ 3,6-anhydro-L-galactopyranose มีราคาประมาณ 200 บาทต่อกรัม
อะกาโรสมักถูกใช้ในงานด้านชีวโมเลกุลสำหรับการแยกดีเอ็นเอและโปรตีนด้วยเทคนิคอิเล็กโตรโฟรีซิส โดยการนำผงอะกาโรสผสมกับสารละลายบัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้นร้อยละ 0.7-2 โดยมวลต่อปริมาตร แล้วนำไปให้ความร้อนก่อนนำไปเทลงในแม่พิมพ์ [1] อะกาโรสที่ใช้ในงานเทคโนโลยีชีวภาพต้องเป็นวุ้นที่มีความบริสุทธิ์และไม่มีประจุทางไฟฟ้า แต่ในขั้นตอนการสกัดวุ้นจะมีปัญหาจากการที่มีโมเลกุลที่มีประจุลบ เรียกว่า อะกาโรเพคติน (agaropectin) ติดมาด้วย เมื่อนำไปใช้งานอิเล็กโทรโฟรีซิสจะก่อให้เกิดปรากฏการณ์อิเล็กโทรเอ็นดอสโมซิส (electroendosmosis ; EEO) [2]
การสกัดอะกาโรสเกิดขึ้นครั้งแรกในปี ค.ศ. 1937 โดยการเติมหมู่อะเซทิลให้แก่วุ้น (acetylating agar) แล้วสกัดออกมาด้วยคลอโรฟอร์ม จากนั้นจึงดึงหมู่อะเซทิลออกด้วยปฏิกิริยา saponification ต่อมามีการใช้สารเคมีในการตกตะกอนอะกาโรเพคตินออกจากอะกาโรสได้ เช่น cetyl-pyridinium chloride, ammonium hydroxide, chitosan, rivanol, acrinol, benzothonium chloride และ carrageenan นอกจากนี้ยังมีการตกตะกอนอะกาโรสด้วย polyethylene glycol ซึ่งแต่ละวิธีที่กล่าวมานี้ เป็นการแยกอะกาโรสออกจากอะกาโรเพคตินในวุ้น [4] จากการศึกษาของ ธารารัตน์ ศุภศิริ พบว่าอะกาโรสจากวุ้นที่สกัดได้จากสาหร่ายทะเลจากจังหวะสงขลาและสตูลด้วยวิธีการต่าง ๆ มีค่าความแข็งแรงของเจลสูงมากกว่า 1,000 g/cm3 โดยการใช้ benzothonium chloride และ DEAE-cellulose chromatography และพบว่าการแยกอากาโรสด้วยวิธี DEAE-cellulose chromatography ให้ผลผลิตภัณฑ์ร้อยละที่สูงมากถึงร้อยละ 86 และยังเป็นอะกาโรสที่มีค่า electroendosmosis ต่ำมากมีค่าเพียง 0.05 เท่านั้น ซึ่งเป็นอากาโรสที่เหมาะจะนำไปพัฒนาและปรับปรุงสำหรับใช้ในงาน isoelectric focusing เป็นอย่างยิ่ง [2] จะเห็นได้ว่าอะกาโรสที่มีการสกัดเพื่อนำมาใช้ในงานทางชีววิทยาโมเลกุลสำหรับการแยกดีเอ็นเอและโปรตีนจะต้องสกัดมาจากสาหร่ายสีแดงซึ่งเป็นการทำลายระบบนิเวศในท้องทะเลและวิธีการสกัดที่ค่อนข้างยุ่งยากหลายขั้นตอน มีการใช้สารเคมีจำนวนมาก อีกทั้งยังใช้งบประมาณในการสกัดที่สูงส่งผลให้อะกาโรสมีราคาแพง ดังนั้นหากสามารถสกัดอะกาโรสจากพืชชนิดอื่น ๆ แทนการใช้สาหร่ายทะเล หรือใช้สารประเภทคาร์โบไฮเดรต เช่น เพคติน จากพืชแทนการใช้วุ้นและอะกาโรสที่สกัดจากสาหร่ายน่าจะช่วยลดขั้นตอนและต้นทุนในการสกัด อีกทั้งยังช่วยลดการทำลายระบบนิเวศในท้องทะเลได้
เครือหมาน้อย (Cissampelos pareira L.var. hirsute(Buch. exDC.) Forman จัดอยู่ในวงศ์ Menispermaceae เป็นพืชที่มีความน่าสนใจเนื่องจากมีการนำมาทำอาหารประเภทวุ้นเพื่อบริโภคของคนในภาคอีสาน โดยนำใบเครือหมาน้อยมาขยำกับน้ำแล้วตั้งทิ้งไว้พบว่ามีการจับตัวกันกลายเป็นวุ้น เนื่องจากในใบหมาน้อยมีเพคตินเป็นองค์ประกอบ โดยพบว่าใบเครือหมาน้อย 100 กรัม สามารถสกัดเป็นเพคตินได้สูงถึง 30 กรัม เพคตินที่พบในหมาน้อยเป็นสารในกลุ่มพอลิแซคคาไรด์ (polysaccharide) ซึ่งประกอบด้วย โพลิเมอร์ของ D – galacturonic acid เป็นสายหลักและมีกิ่งแขนงอาจเป็น arabinose, galactose, rhamnose หมู่คาร์บอกซิล (-COOH) ของ D–galacturonic acid จะถูกเติมหมู่เมทธิล (-CH3) เป็นเมทธิลเอสเทอร์ด้วยปฏิกิริยา esterification ซึ่งคุณสมบัติในการเกิดเจลจะขึ้นอยู่กับ Degree of Methyl Esterification (DM) และมวลโมเลกุลของเพคติน โดย DM คืออัตราส่วนของหมู่ methylated galacturonic acid ต่อหมู่ galacturonic acid ทั้งหมดที่มีอยู่ในโมเลกุลของเพคติน ซึ่งสามารถแบ่งได้ 2 ประเภท ตามค่า DM คือ ชนิด Low methoxyl (LM) ซึ่งจะมีค่า DM น้อยกว่า 50% จะสามารถเกิดเจลได้เมื่อมีไอออนของโลหะอยู่ด้วย เช่น แคลเซียมไอออน และแมกนีเซียมไอออน และชนิด High methoxyl (HM) ซึ่งจะมีค่า DM มากกว่า 50% จะสามารถเกิดเจลได้ในสภาวะที่มีน้ำตาลและกรดในปริมาณที่เหมาะสม [5]
ดังนั้นงานวิจัยนี้ต้องศึกษาคุณสมบัติของสารสกัดวุ้น อะกาโรส และเพคติน จากใบเครือหมาน้อย เพื่อใช้ในการทำอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียและใช้สำหรับแยกดีเอ็นเอแทนการใช้วุ้นและอะกาโรสที่สกัดจากสาหร่ายทะเล