การค้นหาเชื้อราที่สร้าง Chitinase และศึกษาทางอณูชีววิทยาของเชื้อราจากตัวอย่างดิน

ชื่อผู้จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
  • สวรรยา บุรพงศ์กานนท์

อาจารย์ที่ปรึกษาโครงงานวิทยาศาสตร์
  • ทิพา อัศวรักษ์

สถาบันการศึกษาที่กำกับดูแลโครงงานวิทยาศาสตร์

คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล

ระดับการศึกษา

โครงงานในระดับการศึกษาปริญญาโทขึ้นไป

หมวดวิชา

โครงงานในสาขาวิชาชีววิทยา

วันที่จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์

01 มกราคม 2541

บทคัดย่อโครงงานวิทยาศาสตร์

งานวิจัยนี้จะทำการค้นหาเชื้อราที่สามารถสร้างเอนไซม์ chitinase ซึ่งมีประโยชน์มากทั้งในด้านการเกษตร อุตสาหกรรมยา และเครื่องสำอาง จากตัวอย่างดิน เนื่องจากเป็นแหล่งที่มีเชื้อราในปริมาณมาก ขั้นแรกจะทำการแยกเชื้อราจากตัวอย่างดินแหล่งต่างๆ 10 แหล่ง แล้วทำการ isolate จนได้เชื้อราบริสุทธิ์ ( pure culture ) จำนวน 45 isolates และเก็บรักษาเป็น stock cultures ที่อุณหภูมิ 80oc จากนั้นจะทำการแยกหาเชื้อราที่มีความสามารถในการสร้างเอนไซม์ chitinase ในขั้นต้นด้วยวิธี plate assay โดยใช้อาหารที่มี colloidal chitin เป็น substrate เพื่อสังเกต clear zone ที่เกิดขึ้น ซึ่งในขั้นแรกได้ทดลองใช้อาหาร Potato Dextose Agar (PDA) ผสม colloidal chitin แต่ไม่เห็นผล จึงทำการเปลี่ยนเป็นอาหาร chitin selective medium พบเชื้อรา 10 isolates ที่คาดว่าน่าจะสามารถสร้างเอนไซม์ chitinase จึงได้ทำการเลือกตัวอย่างที่มีความน่าสนใจในการสร้างเอนไซม์มาทำการวัด chitinase activity ได้แก่ เชื้อรารหัส CH4 1, CH5 5, CH6 2 และคัดเลือกเชื้อราที่คาดว่ามีความสามารถในการสร้างเอนไซม์ chitinase ทั้ง 10 isolates เพื่อทำการศึกษาทางด้านอณูชีววิทยา โดยการสกัดดีเอ็นเอ ทำ Polymerase chain reaction ( PCR ) โดยใช้ ITS1 และ ITS4 เป็น primers เพื่อ amplify ส่วน rDNA จากนั้นทำการจัดกลุ่มเชื้อราเหล่านี้โดยอาศัยวิธี Amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) นอกจากนี้ PCR products ของเชื้อราที่สนใจจะถูกส่งไปทำ sequencing เพื่อใช้ในการบ่งชี้ชนิดของเชื้อราต่อไป Chitinases is very useful enzyme in agriculture, food, pharmaceutical and cosmetic industry. In this research project, Fungal isolates were screened form 10 soil samples. Total of 45 fungal isolates were purified and kept as stocks at 80oc. Fungal isolates were then screened for their ability to produce chitinase by plate assay method using medium containing colloidal chitin as substrate. In the first attempt for the plate assay, Potato dextrose agar(PDA) with 1% colloidal were used. However, for better visible result, minimal medium with 2% colloidal chitin was used instead. By using this chitin agar selective medium, 10 fungal isolates that are potential chitinase producers were selected. Three fungal isolates, including CH4 1, CH5 5 and CH6 2 were then selected for assay for chitinase activity using colorimetric method. The 10 fungal isolates with ability to produce chitinase on chitin agar selective medium were selected for DNA extraction. The extracted DNA were then used as templates for polymerase chain reaction (PCR), using ITS1 and ITS4 as primers. The PCR products were purified, digested with restriction enzyme for observation of resulting fragment patterns on agarose gel. In addition, PCR products from the fungal isolates of interest were submitted for sequencing for molecular identification.