การทดสอบและเปรียบเทียบคุณสมบัติและประสิทธิภาพของเอนไซม์ไคติเนสที่ผลิตจากสิ่งมีชีวิตที่แตกต่างกันทางพันธุกรรม

ชื่อผู้จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
  • วัฒน์ มิตรธรรมศิริ

อาจารย์ที่ปรึกษาโครงงานวิทยาศาสตร์
  • วิสุทธิ์ ใบไม้

สถาบันการศึกษาที่กำกับดูแลโครงงานวิทยาศาสตร์

นักเรียนระดับมัธยมศึกษาปีที่ 5 โรงเรียนเตรียมอุดมศึกษา กรุงเทพฯ

ระดับการศึกษา

โครงงานในระดับการศึกษาประกาศนียบัตรวิชาชีพ

หมวดวิชา

โครงงานในสาขาวิชาชีววิทยา

วันที่จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์

01 มกราคม 2541

บทคัดย่อโครงงานวิทยาศาสตร์

จากการที่เคยได้ทำโครงการเกี่ยวกับเอนไซม์ไคติเนส ทำให้ได้ข้อสังเกตว่าเอนไซม์ไคติเนสที่ได้จากแบคทีเรียคนละชนิดกันจะมีคุณสมบัติและประสิทธิภาพที่แตกต่างกัน ซึ่งหากเข้าใจถึงความสัมพันธ์ระหว่างชนิดของสิ่งมีชีวิตกับคุณสมบัติและประสิทธิภาพของเอนไซม์ไคติเนส การคัดเลือกเอนไซม์มาใช้ประโยชน์ก็จะมีประสิทธิภาพมากขึ้น ดังนั้นการศึกษาด้านความสัมพันธ์ระหว่างคุณสมบัติและประสิทธิภาพของเอนไซม์ไคติเนสกับความเกี่ยวข้องทางพันธุกรรมจึงนับได้ว่าเป็นสิ่งที่มีประโยชน์ อย่างน้อยที่สุด แม้จะไม่สามารถบ่งชี้ความสัมพันธ์ดังกล่าวได้ชัดเจนแต่ก็จะได้ทราบสมบัติและประสิทธิภาพของเอนไซม์จากสิ่งมีชีวิตที่นำมาศึกษา ซึ่งเป็นประโยชน์ในการนำไปใช้งานให้เหมาะสม ในการศึกษาความสัมพันธ์นี้ ได้อาศัยเอนไซม์จากสิ่งมีชีวิต 3 ชนิด ได้แก่ เชื้อรา 1 ชนิด และเชื้อแบคทีเรีย 2 ชนิด โดยคัดเลือกเชื้อที่ผลิตเอนไซม์ออกมานอกเซลล์ ซึ่งสามารถสังเกตได้จากการเกิดวงในบนวุ้นอาหารที่ผสมคอลลอยด์ไคตินลงไปด้วย จากนั้นแยกเชื้อมาเลี้ยงในอาหารเหลวที่มีเพียงแร่ธาตุกับคอลลอยด์ไคติน เพื่อให้เชื้อราและแบคทีเรียผลิตเอนไซม์ออกมา หลังจากที่สังเกตได้ชัดเจนแล้วว่าเชื้อราและแบคทีเรียที่ได้เพาะลงในอาหารเหลวนั้นมีการเจริญเติบโตก็ตรวจการย่อยไคตินของเอนไซม์ไคติเนสทุกวัน พบว่าในแบคทีเรียชนิดที่ 1 อาศัยเวลาเพียง 1 วัน นับจากวันที่เพาะเชื้อก็สามารถตรวจพบการย่อยไคตินของเอนไซม์ได้อย่างชัดเจน ในแบคทีเรียชนิดที่ 2 ต้องอาศัยเวลาประมาณ 3 วัน สำหรับในเชื้อรานั้น เริ่มสังเกตเห็นว่ามีเชื้อเจริญเติบโตอยู่ในอาหารเหลวได้ชัดเจนในวันที่ 3 แต่ไม่สามารถตรวจพบการทำงานของเอนไซม์ไคติเนสได้ ดังนั้น จึงมิได้นำเอนไซม์ไคติเนสจากเชื้อรามาทดลองในขั้นต่อมา ในวันเดียวกันกับที่ตรวจพบการทำงานของเอนไซม์นั้น ก็ได้สกัดเอนไซม์ไคติเนสของสิ่งมีชีวิตที่ตรวจพบการทำงานนั้นมาทำการทดลองหา pH และอุณหภูมิที่เหมาะสม โดยการดูดเอาของเหลวที่มีเชื้อเจริญเติบโตอยู่ไปทำการเซนทริฟิวจ์ที่ความเร็วประมาณ 10,000 รอบ/นาที เป็นเวลาประมาณ 5 นาที เพื่อตกตะกอนแยกเซลล์และตะกอนต่างๆ รวมทั้งคอลลอยด์ไคตินออกไป และเอนไซม์ที่นำมาทำการทดลองก็จะเป็นลักษณะของ clued extract โดยดูดเอาเฉพาะสารละลายที่อยู่ด้านบน (ซึ่งมีเอนไซม์ไคติเนสละลายอยู่ด้วย) มาใช้ตรวจสอบประสิทธิภาพที่สภาวะต่างๆ ในการควบคุมสภาวะให้เป็นไปตามที่ต้องการจะศึกษานั้น สำหรับการหา pH ที่เหมาะสม จะใช้ buffer ในการควบคุม pH ให้เป็นไปตามที่ต้องการ อันได้แก่ acetate buffer ( pH 5, 6![^0](/latexrender/pictures/a25/a25ffb294dc6b205216b93c57a969824.gif) ) , phosphate buffer (pH 7), และ tris buffer ( pH 8, 9![^0](/latexrender/pictures/a25/a25/a25ffb294dc6b205216b93c57a969824.gif) ) โดยศึกษาที่อุณหภูมิ 30![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) หลังจากได้ผลการทดลองหา pH ที่เหมาะสมแล้ว นำผลที่ได้มาปรับใช้เพื่อการหาอุณหภูมิที่เหมาะสม โดยควบคุมให้เอนไซม์ไคติเนสจากแต่ละแหล่งอยู่ใน pH ที่เหมาะสมของตนเองแล้วใช้หลักการ water bath ในการควบคุมอุณหภูมิ และตรวจสอบประสิทธิภาพของเอนไซม์ที่อุณหภูมิต่างๆ ได้แก่ 20 , 30 , 40 , 50 , 60![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) สำหรับวิธีการตรวจสอบประสิทธิภาพของเอนไซม์ไคติเนส ทำได้โดยอาศัยการตรวจสอบปริมาณ substrate (คือ คอลลอยด์ไคตินนั่นเอง) ที่ลดลงในช่วงระยะเวลาเท่าๆกัน การตรวจสอบปริมาณ substrate อาศัยหลักการที่ว่าคอลลอยด์นั้นจะมีสมบัติการดูดกลืนแสง ยิ่งมีความเข้มข้นของคอลลอยด์มากก็จะทำให้แสงส่องผ่านได้น้อย เมื่อเอนไซม์ไคติเนสย่อยคอลลอยด์ไคตินไปแล้ว ความเข้มข้นของคอลลอยด์ย่อมลดลง แสงก็จะส่องผ่านมากขึ้น อุปกรณ์ที่ใช้ตรวจสอบปริมาณแสงที่ส่องผ่าน คือเครื่อง spectrophotometer ในการตรวจสอบจะบรรจุสารต่างๆลงใน คิวเวต ได้แก่ คอลลอยด์ไคตินมรายอมให้แสงความยาวคลื่น 650 nm ผ่านได้ 25% (เพื่อเป็น substrate) buffer ควบคุม pH และเอนไซม์ไคติเนส โดยใช้อัตราส่วน 1:1:2 ตามลำดับ จากนั้น นำคิวเวตดังกล่าวไปควบคุมสภาวะตามต้องการใน water bath แล้วนำมาวัดเปอร์เซ็นต์แสงส่องผ่าน (%T : Percent Transmission) ด้วยแสงที่มีความยาวคลื่น 650 nm โดยเก็บค่า %T 15 นาที/ครั้ง/คิวเวต เป็นเวลารวม 60 นาที และเปรียบเทียบว่า %T มีอัตราการเพิ่มมากน้อยเพียงใด ซึ่งผลที่ได้รับ มีดังนี้ เอนไซม์ไคติเนสจากเชื้อแบคทีเรียชนิดที่ 1 pH ที่เหมาะสม คือประมาณ 7 เมื่อควบคุมอุณหภูมิที่ 30![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) pH ที่ทำงานได้น้อยที่สุดในช่วง 5 9 คือประมาณ 6 มีแนวโน้มที่จะทำงานในสภาพที่เป็นเบสได้ดีกว่าสภาพที่เป็นกรด อุณหภูมิที่เหมาะสมคือ ประมาณ 40![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) สามารถทำงานได้ตั้งแต่อุณหภูมิ 20 50![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/568/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) โดยอุณหภูมิที่สูงขึ้นจะทำงานได้ดีกว่าที่อุณหภูมิต่ำ ที่ 60![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/568/568/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) เอนไซม์ไคติเนสสามารถทำงานได้เพียงระยะเวลาสั้นๆ (ประมาณ 15 นาที) หลังจากนั้นจะไม่สามารถทำงานได้ เอนไซม์ไคติเนสจากเชื้อแบคทีเรียชนิดที่ 2 pH ที่เหมาะสม คือประมาณ 8 เมื่อควบคุมอุณหภูมิที่ 30![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/568/568/568/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) pH ที่ทำงานได้น้อยที่สุดในช่วง 5 9 คือประมาณ 5 มีแนวโน้มที่จะทำงานในสภาพที่เป็นเบสได้ดีกว่าสภาพที่เป็นกรด อุณหภูมิที่เหมาะสมคือ ประมาณ 40![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/568/568/568/568/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) สามารถทำงานได้ตั้งแต่อุณหภูมิ 20 − 50![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/568/568/568/568/568/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) โดยอุณหภูมิที่สูงขึ้นจะทำงานได้ดีกว่าที่อุณหภูมิต่ำ ที่ 60![^0C](/latexrender/pictures/a25/a25/568/568/568/568/568/568/568/568/568/568/5682f72a92cae9609b0ece4d3593c0b3.gif) เอนไซม์ไคติเนสไม่สามารถทำงานได้