การพัฒนาเอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทสของเชื้อมาลาเรียฟัลซิปารั่มโดยเชื่อมต่อกับ INTEIN เพื่อประยุกต์สำหรับการแยกบริสุทธิ์

ชื่อผู้จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์
  • ดวงพร วนาพรรณ์

อาจารย์ที่ปรึกษาโครงงานวิทยาศาสตร์
  • ยงยุทธ ยุทธวงศ์

  • วรชาติ สิรวราภรณ์

สถาบันการศึกษาที่กำกับดูแลโครงงานวิทยาศาสตร์

นักศึกษาระดับปริญญาตรีปีที่ 1 มหาวิทยาลัยมหิดล

ระดับการศึกษา

โครงงานในระดับการศึกษาปริญญาโทขึ้นไป

หมวดวิชา

โครงงานในสาขาวิชาชีววิทยา

วันที่จัดทำโครงงานวิทยาศาสตร์

01 มกราคม 2541

บทคัดย่อโครงงานวิทยาศาสตร์

กลไกการดื้อยาแอนตี้โฟเลตในเชื้อมาลาเรีย เกิดเนื่องจากการที่ลำดับเบสบางตำแหน่งของยีนไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทส (dihydrofolate reductase , DHFR) เปลี่ยนแปลงไป เป็นผลทำให้เอ็นไซม์ไม่สามารถจับกับยาได้แน่นเท่าเดิม และทำให้เกิดปัญหาการแยกบริสุทธิ์ของเอ็นไซม์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเอ็นไซม์ดื้อยาซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโน 4 ตำแหน่ง และไม่จับกับ Methotrexate (MTX) Sepharose ซึ่งใช้เป็น affinity resin ในการแยกบริสุทธิ์เอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทสของมาลาเรียฟัลซิปารั่ม โครงงานนี้มีวัตถุประสงค์ที่จะพัฒนาวิธีการแยกบริสุทธิ์เอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทสของมาลาเรียที่ดื้อยาแอนตี้โฟเลต ซึ่งไม่จับกับ MTX Sepharose resin โดยทำการตัดต่อยีนสังเคราะห์ DHFR ของเชื้อมาลาเรียฟัลซิปารั่ม (pfDHFR) เข้าไปยังพาหะ pCYB1 และ / หรือ pTYB1 ทำให้เชื่อมต่อยีน pfDHFR เข้ากับปลายด้านอะมิโนด้านโปรตีน INTEIN (splicing element ของยีสต์ Saccharomyces cerevisiae) ซึ่งได้เชื่อมต่อกับส่วนของโปรตีนที่สามารถจับกับไคติน (Chitin Binding Domain , CBD) พลาสมิดสายผสมที่ได้ (pCYpfDHFR) และ / หรือ pTYpfDHFR ตามลำดับ) จะถูกนำมาศึกษาการแสดงออก (expression) ด้วยการเหนี่ยวนำด้วย isopropyl −1− thio − β − D − galactopyranoside(IPTG) ที่สภาวะอุณหภูมิและเวลาต่าง ๆ เอ็นไซม์ที่แสดงอกถูกนำมาแยกบริสุทธิ์ และศึกษาสมบัติทางด้านจลศาสตร์และการยับยั้งด้วยแอนตี้โฟเลตไพริเมธามีน (pyrimethamine) และไซโคลกัวนิล (cycloguanil) ผลการทดลองพบว่าเอ็นไซม์ที่อยู่ในลักษณะเชื่อมต่อกับ INTEIN จะสามารถถูกแยกบริสุทธิ์ได้ด้วยคอลัมม์ chitin ตลอดจนมีคุณสมบัติจลศาสตร์ และการถูกยับยั้งด้วยไพริเมธามีนและไซโคลกัวนิลไม่แตกต่างกับเอ็นไซม์ pfDHFR ซึ่งไม่ได้เชื่อมต่อกับ INTEIN